本發(fā)明屬于花生栽培方法，特別涉及一種搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法。
背景技術(shù)：
1、花生(arachis?hypogaea?l.)起源于南美洲，是一種重要的油料經(jīng)濟(jì)作物，由于較高的含油量而在世界五大油料作物中穩(wěn)居第三的位置?；ㄉ菃萎a(chǎn)潛力最高的油料作物且在中國各地均有種植，并劃分為7個花生產(chǎn)區(qū)，其中東北花生產(chǎn)區(qū)、黃河流域花生產(chǎn)區(qū)、長江流域花生產(chǎn)區(qū)和南方花生產(chǎn)區(qū)是主要的花生產(chǎn)區(qū)。河南省大部位于黃河流域花生生產(chǎn)區(qū)，其花生種植又分被為四個區(qū)，分別為豫南產(chǎn)區(qū)、豫東產(chǎn)區(qū)、豫中產(chǎn)區(qū)和豫北產(chǎn)區(qū)。近兩年，河南省花生種植面積居全國第一位，均在2200萬畝以上。花生是重要的油料作物，大力發(fā)展花生生產(chǎn)在我國農(nóng)業(yè)上具有重要意義。然而，近年來化肥和農(nóng)藥的濫用以及不科學(xué)的施肥方法導(dǎo)致豆科植物的產(chǎn)量和品質(zhì)大大下降，同時土壤板結(jié)、酸堿化等問題也日益凸顯。生物固氮是大氣中氮氣轉(zhuǎn)化為氨的自然過程，可以由自由生活的、聯(lián)合的、內(nèi)生的和共生的根際細(xì)菌來實現(xiàn)，其統(tǒng)稱為根瘤菌，它們與豆科植物形成共生關(guān)系，其中植物宿主向根瘤菌提供養(yǎng)分，而根瘤菌以氨的形式向宿主提供固定的大氣氮素。最終可以達(dá)到促進(jìn)作物生長、減輕作物病害、改善作物產(chǎn)量和質(zhì)量等目的。
2、根瘤菌是與豆科植物共生的一類桿狀細(xì)菌，它們形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養(yǎng)。正常細(xì)胞以鞭毛運(yùn)動，無芽孢，革蘭氏染色陰性，為需氧型生物，根瘤菌可利用多種碳水化合物，并產(chǎn)生相當(dāng)量的胞外粘液。目前，慢生根瘤菌劑的研究主要集中在大豆慢生根瘤菌上。吳萍等人對大豆根瘤菌ahm2b菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)大豆根瘤菌ahm2b菌株在bse培養(yǎng)基中生長較快，其次是yma和ty培養(yǎng)基，在pa培養(yǎng)基中生長最慢(吳萍，李正鵬，何慶元，等.大豆根瘤菌ahm2b菌株培養(yǎng)條件的篩選與優(yōu)化[j].大豆科學(xué)，2014，33(06):953-956.)。吳紅慧和周俊初以大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobium?japonicum)usda110作為供試菌，進(jìn)行yma、ty、sm、pa和bse等5種培養(yǎng)基的比較試驗，兩種試驗菌株均在bse培養(yǎng)基中生長速度最快，并對usda110進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗，提高了菌株的生長效率，但是在搖瓶中的濃度還是很低，對于慢生根瘤菌菌劑的搖瓶制備僅達(dá)到109水平，達(dá)不到很高的密度(吳紅慧，周俊初.根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化和劑型的比較研究[j].微生物學(xué)通報，2004，(02):14-19.)。專利201510658106.5中提供了一種花生根瘤菌培養(yǎng)基，采用甘油、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸等物質(zhì)組成混合碳源，通過精確控制碳源、氮源和礦質(zhì)營養(yǎng)元素的平衡，來優(yōu)化根瘤菌的生長環(huán)境，該培養(yǎng)基發(fā)酵制備的日本慢生根瘤菌菌劑在20℃保存12個月活菌數(shù)達(dá)每毫升100億以上，但培養(yǎng)基成分中含有多種化學(xué)物質(zhì)和營養(yǎng)成分，成本較高，不利于推廣和應(yīng)用。發(fā)酵培養(yǎng)基在花生慢生根瘤菌的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用，因此，通過不斷優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵條件，有望實現(xiàn)花生慢生根瘤菌菌劑的高效環(huán)保、低成本的生產(chǎn)和應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提出一種高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法及其應(yīng)用，發(fā)酵得到高密度花生根瘤菌菌劑，具有高效環(huán)保、工藝流程簡便和成本較低的特點，為花生慢生根瘤菌菌劑的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供技術(shù)支持。
2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
3、一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N改良yga培養(yǎng)基，包括以下組分：葡萄糖為7-15g，k2hpo4為0.15-0.35g，kh2po4為0.15-0.35g，無水mgso4為0.1-0.3g，nacl為0.05-0.15g，酵母粉為2-5g，水為1000ml，ph為6.8-7.2。
4、優(yōu)選的，上述的改良yga培養(yǎng)基，具體包括以下組分：葡萄糖為12g，k2hpo4為0.25g，kh2po4為0.25g，無水mgso4為0.1g，nacl為0.1g，酵母粉為4g，水為1000ml，ph為7。
5、種子液的制備，將純化后的花生慢生根瘤菌菌株接入yma液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)5d，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，搖好的菌液調(diào)od600值為1.0備用。
6、第二方面，本申請還提供了一種高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，所述方法是基于上述的改良yga培養(yǎng)基實現(xiàn)的。
7、優(yōu)選的，上述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，步驟為：將花生慢生根瘤菌的種子液接種于改良yga培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到高密度花生慢生根瘤菌菌劑，菌劑od600為8.5-9.5。
8、優(yōu)選的，上述種子液的接種量為1-5％。
9、優(yōu)選的，上述培養(yǎng)的條件為在25-32℃，150-200r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)5-8d。
10、第三發(fā)明，上述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法制備的高密度花生慢生根瘤菌菌劑。
11、優(yōu)選的，上述菌劑的濃度大于1011cfu/ml。
12、第四方面，上述的高密度花生慢生根瘤菌菌劑在花生種植中的應(yīng)用。
13、優(yōu)選的，上述的應(yīng)用的步驟為：將高密度花生慢生根瘤菌菌劑與花生種子混拌均勻。
14、本發(fā)明具有以下有益效果：
15、本申請使用改良yga培養(yǎng)基對花生慢生根瘤菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，制備得到高密度花生慢生根瘤菌菌劑，菌劑的有效活菌數(shù)大于1011cfu/ml，在發(fā)酵168h后表現(xiàn)出與yma培養(yǎng)基、myma培養(yǎng)基、ty培養(yǎng)基、ymar培養(yǎng)基、zjc培養(yǎng)基和yds培養(yǎng)基的顯著性差異，最終od600是yma培養(yǎng)基的1.26倍，myma培養(yǎng)基的1.1倍，ty培養(yǎng)基的12.41倍，ymar培養(yǎng)基的4.42倍，zjc培養(yǎng)基的2.2倍，yds培養(yǎng)基的2.86倍，發(fā)酵效果顯著高于現(xiàn)有的培養(yǎng)基。本申請通過優(yōu)化yga培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵條件，實現(xiàn)花生慢生根瘤菌菌劑的高密度搖瓶發(fā)酵，且制備方法高效環(huán)保、工藝流程簡單、成本相對較低，具有生產(chǎn)和應(yīng)用的潛力。
1.?一種改良yga培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：葡萄糖為7-15?g，k2hpo4為0.15-0.35?g，kh2po4為0.15-0.35?g，無水mgso4為0.1-0.3?g，nacl為0.05-0.15?g，酵母粉為2-5g，水為1000?ml，ph為6.8-7.2。
2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良yga培養(yǎng)基，其特征在于，具體包括以下組分：葡萄糖為12?g，k2hpo4為0.25?g，kh2po4為0.25?g，無水mgso4為0.1?g，nacl為0.1?g，酵母粉為4?g，水為1000?ml，ph為7。
3.一種高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，其特征在于：所述方法是基于權(quán)利要求1或2所述的改良yga培養(yǎng)基實現(xiàn)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，其特征在于，步驟為：將花生慢生根瘤菌的種子液接種于改良yga培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到高密度花生慢生根瘤菌菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，其特征在于：所述種子液的接種量為1-5%。
6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)的條件為在25-32℃，150-200?r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)5-8?d。
7.權(quán)利要求3-6任一項所述的高密度搖瓶發(fā)酵花生慢生根瘤菌的方法制備的高密度花生慢生根瘤菌菌劑。
8.?根據(jù)權(quán)利要求7所述的高密度花生慢生根瘤菌菌劑，其特征在于：所述菌劑的濃度大于1011?cfu/ml。
9.權(quán)利要求8所述的高密度花生慢生根瘤菌菌劑在花生種植中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟為：將高密度花生慢生根瘤菌菌劑與花生種子混拌均勻。