本發(fā)明涉及新穎孔單體、由所述孔單體形成的孔以及其在分析物檢測和表征中的用途。

背景技術：

1、納米孔感測是分析物檢測和表征方法，其依賴于對分析物分子與離子傳導通道之間的單獨結合或相互作用事件的觀察結果。使用納米孔感測進行分析物表征的基本組分中的兩者是(1)控制分析物移動通過孔，以及(2)在分析物移動通過孔時辨別組成結構單元。在納米孔感測期間，孔的最窄部分形成納米孔的相對于隨通過的分析物的變化的電流特征的最具辨別力的部分。

2、對于多核苷酸分析物，通過測量多核苷酸穿過孔時的電流來實現(xiàn)核苷酸辨別。多個核苷酸對觀察到的電流有貢獻，因此通道收縮的高度和與多核苷酸相互作用的程度影響觀察到的電流與多核苷酸序列之間的關系。雖然通過蛋白孔的突變已經(jīng)改善了核苷酸辨別的電流范圍和信噪比，但是如果可以進一步改善核苷酸之間的電流差異，則測序系統(tǒng)將具有更高的性能。因此，需要鑒定改進納米孔感測特征的新穎方法。

3、ghanem等人(2022),《歐洲生物化學學會聯(lián)合會雜志(febs?j)》,289:3505-3520公開了α-溶血素和γ-溶血素的嵌合突變體。然而，這些嵌合突變體并未用于納米孔感測。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明者令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由至少兩個不同的孔形成的嵌合孔與嵌合體所源自的不同的孔相比，在分析物表征期間顯示出信噪比(snr)增加、電流范圍增加、噪聲減少和歸一化中值絕對偏差(nmad)增加。snr增加、電流范圍增加、噪聲減少和nmad增加提高了在分析物穿過孔時孔辨別分析物的能力。因此，本發(fā)明提供了一種嵌合孔單體，其包含兩個或更多個區(qū)，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔，并且其中所述至少兩個不同的孔不包含α-溶血素和γ-溶血素。

2、本發(fā)明還提供了：

3、-一種嵌合構建體，其包含兩個或更多個本發(fā)明的共價附接的嵌合孔單體；

4、-一種嵌合孔，其包含至少一個本發(fā)明的嵌合孔單體或至少一種本發(fā)明的構建體；

5、-一種嵌合孔多聚體，其包含兩個或更多個孔，其中所述孔中的至少一個孔是本發(fā)明的嵌合孔；

6、-一種本發(fā)明的嵌合孔或一種本發(fā)明的嵌合孔多聚體，其包含在膜中。

7、-一種膜，其包含本發(fā)明的嵌合孔或本發(fā)明的嵌合孔多聚體；

8、-一種用于產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合孔單體的方法，所述方法包含附接來自至少兩個不同的孔的所述至少兩個區(qū)；

9、-一種用于確定目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性的方法，所述方法包含以下步驟：

10、(i)使所述目標分析物與以下接觸：(a)包含兩個或更多個區(qū)的嵌合孔，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔或(b)包含兩個或更多個孔的嵌合孔多聚體，其中至少一個孔是(a)中定義的嵌合孔；以及

11、(ii)在所述目標分析物相對于所述孔或孔多聚體移動時進行一次或多次測量，并且由此確定所述目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性；

12、-一種使用以下表征目標分析物的方法：(a)包含兩個或更多個區(qū)的嵌合孔，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔或(b)包含兩個或更多個孔的嵌合孔多聚體，其中至少一個孔是(a)中定義的嵌合孔；

13、-一種(a)包含兩個或更多個區(qū)的嵌合孔，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔或(b)包含兩個或更多個孔的嵌合孔多聚體，其中至少一個孔是(a)中定義的嵌合孔的用途，其用于確定目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性；

14、-一種用于表征靶多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包含：

15、-(a)包含兩個或更多個區(qū)的嵌合孔，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔或(b)包含兩個或更多個孔的嵌合孔多聚體，其中至少一個孔是(a)中定義的嵌合孔；以及

16、-多核苷酸結合蛋白；

17、-一種用于表征樣品中的靶多核苷酸的設備，所述設備包含：

18、-(a)包含兩個或更多個區(qū)的多個嵌合孔，其中所述兩個或更多個區(qū)中的至少兩個區(qū)來自至少兩個不同的孔或(b)包含兩個或更多個孔的多個嵌合孔多聚體，其中至少一個孔是(a)中定義的嵌合孔；以及

19、-多個多核苷酸結合蛋白；

20、-一種多核苷酸，其編碼本發(fā)明的嵌合孔單體或本發(fā)明的嵌合構建體；

21、-一種用于表征目標分析物的試劑盒，所述試劑盒包含(a)本發(fā)明的嵌合孔或本發(fā)明的嵌合孔多聚體，以及(b)膜的組分；

22、-一種陣列，其包含多個本發(fā)明的膜；

23、-一種系統(tǒng)，其包含(a)本發(fā)明的膜或本發(fā)明的陣列，(b)用于跨膜施加電勢的裝置以及(c)用于檢測跨膜的電信號或光信號的裝置；

24、-一種設備，其包含插入到體外膜中的本發(fā)明的嵌合孔或本發(fā)明的嵌合孔多聚體；以及

25、-一種通過包含以下的方法產(chǎn)生的設備：(i)獲得本發(fā)明的嵌合孔或本發(fā)明的嵌合孔多聚體，以及(ii)使所述嵌合孔或孔多聚體與體外膜接觸，使得所述嵌合孔或所述孔多聚體插入在所述體外膜中。

26、本發(fā)明者還令人驚訝地表示，來自不同物種的porarc孔能夠以高信噪比(snr)、良好的電流范圍、最小的噪聲和良好的歸一化中值絕對偏差(nmad)進行納米孔感測。因此本發(fā)明提供了一種porarc孔單體，其包含與seq?id?no:2所示的序列具有至少88％同一性的序列或與seq?id?no:50、51、52、53、54或55所示的序列具有至少約20％同一性的序列。

27、本發(fā)明還提供了：

28、-一種porarc構建體，其包含兩個或更多個本發(fā)明的共價附接的porarc孔單體；

29、-一種porarc孔，其包含至少一個本發(fā)明的porarc孔單體或至少一種本發(fā)明的構建體；

30、-一種porarc孔多聚體，其包含兩個或更多個孔，其中所述孔中的至少一個孔是本發(fā)明的porarc孔；

31、-一種本發(fā)明的porarc孔或一種本發(fā)明的porarc孔多聚體，其包含在膜中；

32、-一種膜，其包含本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體；

33、-一種用于確定目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性的方法，所述方法包含以下步驟：

34、(i)使所述目標分析物與本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體接觸；以及

35、(ii)在所述目標分析物相對于所述孔或孔多聚體移動時進行一次或多次測量，并且由此確定所述目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性；

36、-一種使用本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體表征目標分析物的方法；

37、-一種本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體的用途，其用于確定目標分析物的存在、不存在或一種或多種特性；

38、-一種用于表征靶多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包含(a)本發(fā)明的porarc孔或根據(jù)本發(fā)明的權利要求的porarc孔多聚體以及(b)多核苷酸結合蛋白；

39、-一種用于表征樣品中的靶多核苷酸的設備，所述設備包含：(a)多個本發(fā)明的porarc孔或多個本發(fā)明的porarc孔多聚體以及(b)多個多核苷酸結合蛋白；

40、-一種多核苷酸，其編碼本發(fā)明的porarc孔單體或本發(fā)明的porarc構建體；

41、-一種用于表征目標分析物的試劑盒，所述試劑盒包含(a)本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體，以及(b)膜的組分；

42、-一種陣列，其包含多個本發(fā)明的膜；

43、-一種系統(tǒng)，其包含(a)本發(fā)明的膜或本發(fā)明的陣列，(b)用于跨膜施加電勢的裝置以及(c)用于檢測跨膜的電信號或光信號的裝置；

44、-一種設備，其包含插入到體外膜中的本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體；以及

45、-一種通過包含以下的方法產(chǎn)生的設備：(i)獲得本發(fā)明的porarc孔或本發(fā)明的porarc孔多聚體，以及(ii)使所述嵌合孔或孔多聚體與體外膜接觸，使得所述嵌合孔或所述孔多聚體插入在所述體外膜中。