本發(fā)明屬于植物快速繁殖，具體涉及一種次郎柿離體葉片的再生方法。

背景技術(shù)：

1、柿屬（ diospyros）為柿科（ebenaceae）中最大屬，世界范圍內(nèi)約存在500種，大多分布于熱帶地區(qū)，極少數(shù)存在于溫帶，其中亞洲約有200種。柿具有諸多效益，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊，但其童期長(zhǎng)、實(shí)生苗繁殖效率低且難以保持原品種的優(yōu)良性狀。建立完善的組織培養(yǎng)體系，一方面有利于解決產(chǎn)業(yè)難題，另一方面有利于開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能研究。

2、休眠芽和活動(dòng)芽是目前柿的組織培養(yǎng)技術(shù)中較為常用的外植體，大多數(shù)品種的休眠芽的最佳采集時(shí)期是當(dāng)年12月至翌年3月，活動(dòng)芽則在8月至11月，受季節(jié)限制嚴(yán)重；且田間采集的休眠芽帶有大量雜菌，需要進(jìn)行復(fù)雜的消毒處理，消毒劑殺死雜菌的同時(shí)也會(huì)對(duì)外植體本身造成極大的損傷；因此，通過(guò)休眠芽獲得組培苗，其成活率受多種因素的限制。

3、除休眠芽外，種胚也是較為常見(jiàn)的外植體，相比于芽作外植體，其優(yōu)點(diǎn)在于，一是種胚受種皮和胚乳的保護(hù)，消毒更容易，污染率低；二是一個(gè)種胚為一個(gè)基因型，利用其組培苗實(shí)現(xiàn)擴(kuò)繁，可以固定基因型，進(jìn)而有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性。但一個(gè)種子只有一個(gè)胚，對(duì)于種子較少的甜柿品種而言，需要消耗大量柿果實(shí)，取材較為困難。

4、柿屬植物組織培養(yǎng)也可以通過(guò)葉片或帶葉莖段開(kāi)展，這兩種外植體來(lái)源于上述方式獲得的組培苗。相比于莖段，葉片在材料數(shù)量上更豐富，并且用葉片實(shí)現(xiàn)再生會(huì)經(jīng)歷愈傷組織階段，更有利于侵染，便于開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能研究。此外，已建立的柿遺傳轉(zhuǎn)化體系多以種胚為侵染受體，種胚間基因型不同，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定；而以種胚獲得的組培苗的葉片為侵染受體，可以固定基因型，提高遺傳轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性。

5、現(xiàn)有柿屬植物的組織培養(yǎng)研究中，不同種甚至是品種之間的組織培養(yǎng)再生體系也存在較大差異，如‘君遷子’（ d.?lotus）萌動(dòng)芽和休眠芽的成活率約40%~60%，離體葉片不定芽再生率最高可達(dá)85%，不定芽數(shù)約2~6個(gè)；‘小果甜柿’（ diospyros?kaki?thunb.?‘xiaoguotianshi’）的愈傷誘導(dǎo)率為64.71%，不定芽再生率和不定芽數(shù)分別為31.11%和2.37個(gè)；油柿（ d.?oleifera?cheng）愈傷組織誘導(dǎo)率也可達(dá)88.90%，不定芽誘導(dǎo)率為64.33%，平均不定芽數(shù)為3.7個(gè)。綜上所述，可見(jiàn)不同柿愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)能力存在較大差異，可能是由于遺傳背景差異較大造成的，其體系無(wú)法簡(jiǎn)單套用。

6、‘次郎’是商品性較好的完全甜柿良種，相較于‘太秋’‘富有’等甜柿良種，‘次郎’的生長(zhǎng)適應(yīng)性好，常被用作遺傳轉(zhuǎn)化研究材料。目前，關(guān)于次郎柿離體葉片的再生研究很少。馬俊蓮等人（‘富有’和‘次郎’甜柿葉片再生植株的研究.園藝學(xué)報(bào),?2006,?33(5):1048-1050.）的研究建立了次郎甜柿葉片再生植株的體系，但仍存在很大改進(jìn)空間，主要包括：（1）該研究以‘次郎’的休眠芽為外植體，獲得的組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱；（2）誘導(dǎo)芽使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是tdz、zt和naa，從試驗(yàn)效果上，存在以下問(wèn)題：添加naa誘導(dǎo)出的愈傷組織不具備分化能力；當(dāng)tdz濃度超過(guò)0.50?mg/l時(shí)，形成的不定芽短小，節(jié)間短，多為叢生苗，不利于再生苗的快速繁殖；當(dāng)tdz為0.50?mg/l時(shí)，愈傷形成率和不定芽分化率均達(dá)到96%，但處理35天后，組培苗存在矮化叢生現(xiàn)象，不利于多次繼代分化；（3）其組培苗經(jīng)兩次繼代后株高僅1.50?cm，不利于更好的開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化研究。以該再生體系為基礎(chǔ)的次郎遺傳轉(zhuǎn)化效率低，侵染后分化率為27%，陽(yáng)性苗得率僅1.6%（申曉鴻.?次郎柿acc合成酶轉(zhuǎn)基因及生根移栽體系的研究[d].河北農(nóng)業(yè)大學(xué),?2007.）。因此，亟需進(jìn)一步優(yōu)化柿葉片等器官的再生體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種次郎柿離體葉片的再生方法，該方法以次郎柿組培苗的葉片為外植體，該外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得愈傷組織，進(jìn)行繼代培養(yǎng)后獲得再生芽，在成苗培養(yǎng)基上獲得健壯組培苗，對(duì)其進(jìn)行生根處理后獲得生根后的組培苗，并進(jìn)行煉苗移栽，為次郎柿組培苗的快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要的技術(shù)支持。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種次郎柿離體葉片的再生方法，包括以下步驟：

3、s1、材料準(zhǔn)備

4、采集次郎柿果實(shí)，取種子進(jìn)行清洗和消毒，然后將種胚接種到胚生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，光培養(yǎng)，獲得次郎柿組培苗；所述胚生長(zhǎng)培養(yǎng)基為（1/2n）ms+70.00?g/l蔗糖+7.00?g/l瓊脂+3.00?g/l活性炭+0.44?mg/l玉米素+0.30?mg/l吲哚丁酸，ph為5.8~6.0；

5、s2、初代培養(yǎng)

6、選繼代2~4次的長(zhǎng)勢(shì)健壯且均一的次郎柿組培苗，無(wú)菌條件下取頂端第2~5片展開(kāi)葉作為外植體，切除葉片四周邊緣，剪切成8?mm2大小，葉背朝上接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為（1/2n）ms+30.00?g/l蔗糖+7.00?g/l瓊脂+0.60?g/l聚乙烯吡咯烷酮+（1.00~5.00）mg/l玉米素+（0.01~1.00）mg/l生長(zhǎng)素，ph為5.8~6.0；

7、s3、增殖培養(yǎng)

8、將s2得到的不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生健壯組培苗；所述成苗培養(yǎng)基為（1/2n）ms+30.00?g/l蔗糖+7.00?g/l瓊脂+0.60?g/l聚乙烯吡咯烷酮+（1.00~2.00）mg/l玉米素+（0.01~0.1）mg/l生長(zhǎng)素，ph為5.8~6.0；

9、s4、生根培養(yǎng)

10、將s3得到的組培苗莖基部在吲哚丁酸溶液中浸泡10?min，接種至（1/2n）ms培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)光培養(yǎng)，25~35天后獲得生根的組培苗；

11、s5、煉苗移栽

12、將s4得到的生根的組培苗在組培室中每天增加開(kāi)蓋幅度，第一天開(kāi)蓋10%，第二天開(kāi)蓋50%，第三天完全開(kāi)蓋；然后用無(wú)菌水清洗根部，移栽至滅菌過(guò)的由營(yíng)養(yǎng)土和蛭石組成的混合基質(zhì)中，人工氣候箱培養(yǎng)40天，移栽。

13、優(yōu)選地，s1中所述次郎柿果實(shí)種子清洗和消毒的方法為：在超凈工作臺(tái)外取次郎柿果實(shí)的種子，置于添加0.1%吐溫-20的水溶液中浸泡15?min，流水沖洗1?h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液消毒30?s，無(wú)菌水沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液消毒10min，無(wú)菌水沖洗4~5次。

14、優(yōu)選地，s2中所述誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的方法為：外植體接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)12~20天后，誘導(dǎo)出愈傷組織；在原芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，暗培養(yǎng)20天后可見(jiàn)愈傷組織誘導(dǎo)的芽，再次繼代20天后獲得長(zhǎng)勢(shì)良好的不定芽。

15、優(yōu)選地，s1、s3和s4中所述光培養(yǎng)條件為：溫度23±2℃，光周期16?h/d，光照培養(yǎng)強(qiáng)度15000~20000?lx。

16、優(yōu)選地，s4中所述吲哚丁酸溶液的濃度為（100~300）mg/l。

17、優(yōu)選地，s5中所述混合基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的質(zhì)量比為10:1。

18、優(yōu)選地，s5中所述人工氣候箱的培養(yǎng)條件為：溫度為25℃，濕度為90%，光照為23400?lx，7天后濕度降為75%，溫度和光照條件不變，每周澆水1~2次。

19、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著的技術(shù)效果：

20、本發(fā)明提供了一種次郎柿離體葉片的再生方法，采用組培苗葉片作外植體，誘導(dǎo)效率高，為次郎柿組培苗的快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要的技術(shù)支持，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

21、（1）相同基因型外植體來(lái)源充足。本發(fā)明所采用的外植體為次郎柿子代組培苗的葉片，相較于一粒種子只有一個(gè)成熟胚，組培苗的葉片數(shù)量更多，材料獲取容易，且不易污染，不受季節(jié)限制，提高了柿苗木繁育效率。此外，已建立的柿遺傳轉(zhuǎn)化體系多以種胚為侵染受體，種胚間基因型不同，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定；而以組培苗葉片為侵染受體，可以固定基因型，提高遺傳轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性。

22、（2）再生體系周期短、效率高。本發(fā)明建立的葉片再生體系在外植體接種12~20天后便可誘導(dǎo)出愈傷組織，接種40天時(shí)便可誘導(dǎo)出不定芽，105天可以誘導(dǎo)生根，120天可以盆栽，再生體系誘導(dǎo)效率高，大大縮短了苗木繁育周期。

23、（3）本發(fā)明成苗階段的組培苗株高較前人有大幅提升，90天時(shí)組培苗平均株高可達(dá)3.00?cm，最高株高可達(dá)5.60?cm，葉片嫩綠，節(jié)間適中，多次繼代下可保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

24、下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。