本發(fā)明實(shí)施例涉及生物檢測(cè)，具體涉及一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的探針引物組合、試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、克氏原螯蝦(procambarus?clarkii)，又稱小龍蝦，是一種在全球范圍內(nèi)廣泛分布且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的甲殼類動(dòng)物。其肉質(zhì)鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位。隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)其疾病防控、種群監(jiān)測(cè)以及品質(zhì)鑒定等方面的精準(zhǔn)檢測(cè)需求日益迫切。
2、傳統(tǒng)的克氏原螯蝦檢測(cè)方法，如形態(tài)學(xué)鑒定，主要依賴于專業(yè)人員根據(jù)其外觀特征進(jìn)行判斷，這種方法主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確性低，且對(duì)于幼體或形態(tài)相似的物種難以準(zhǔn)確區(qū)分。而基于生化指標(biāo)的檢測(cè)方法，操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，且靈敏度有限，無(wú)法滿足快速、高效檢測(cè)的需求。
3、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸成為克氏原螯蝦檢測(cè)的重要手段。其中，普通pcr技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因的擴(kuò)增，但存在易污染、無(wú)法進(jìn)行定量分析等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可定量分析等優(yōu)勢(shì)，在克氏原螯蝦檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前針對(duì)克氏原螯蝦的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)技術(shù)中，熒光引物組合的特異性和擴(kuò)增效率參差不齊。部分引物組合特異性不強(qiáng)，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；一些引物組合的擴(kuò)增效率較低，無(wú)法滿足90％-110％的范圍要求，影響了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的探針引物組合、試劑盒及應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：
3、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，本發(fā)明提供一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的探針引物組合，包括探針，上游引物和下游引物，所述探針的核苷酸序列為：5'-fam-ctttacctgtgttggca-mgb-3'，上游引物的核苷酸序列為5'-gctattaatatacgaacagtagggataacc-3'，下游引物的核苷酸序列為5'-caaaaaaagaagtatttagattacgatctg-3'。
4、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第二方面，本發(fā)明提供一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的試劑盒，包括如上所述的探針引物組合。
5、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第三方面，本發(fā)明提供如上所述的探針引物組合，或，如上所述的試劑盒在克氏原螯蝦物種鑒定中的應(yīng)用。
6、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第四方面，本發(fā)明提供一種克氏原螯蝦物種鑒定方法，所述方法包括：
7、(1)提取待測(cè)樣品cdna或者基因組dna；
8、(2)以如上所述的探針、上游引物和下游引物進(jìn)行taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，得到ct值及擴(kuò)增曲線；
9、(3)檢測(cè)結(jié)果判定：ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則結(jié)果為陽(yáng)性；無(wú)ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陰性；ct值>35時(shí)，重做該樣本，若重做結(jié)果無(wú)ct值為陰性，否則為陽(yáng)性。
10、進(jìn)一步地，taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系為：預(yù)混試劑10μl，上游引物10μm0.7μl，下游引物10μm?0.7μl，taqman探針10μm?0.6μl，dna模板1μl，用ddh2o補(bǔ)充至總體積20μl。
11、進(jìn)一步地，taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。
12、本發(fā)明實(shí)施例具有如下優(yōu)點(diǎn)：
13、本發(fā)明提供的taqman探針實(shí)時(shí)熒光pcr的探針和引物組合能夠準(zhǔn)確識(shí)別克氏原螯蝦的目標(biāo)基因，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，能夠簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，降低檢測(cè)成本，為克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的疾病防控和科學(xué)研究提供有力的技術(shù)支持。
1.一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的探針引物組合，其特征在于，包括探針，上游引物和下游引物，所述探針的核苷酸序列為：5'-fam-ctttacctgtgttggca-mgb-3'，上游引物的核苷酸序列為5'-gctattaatatacgaacagtagggataacc-3'，下游引物的核苷酸序列為5'-caaaaaaagaagtatttagattacgatctg-3'。
2.一種鑒定克氏原螯蝦taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的探針引物組合。
3.權(quán)利要求1所述的探針引物組合，或，權(quán)利要求2所述的試劑盒在克氏原螯蝦物種鑒定中的應(yīng)用。
4.一種克氏原螯蝦物種鑒定方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的克氏原螯蝦物種鑒定方法，其特征在于，
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的克氏原螯蝦物種鑒定方法，其特征在于，