本發(fā)明涉及有機(jī)地球化學(xué)，特別涉及一種葉蠟脂類(lèi)化合物族組分分離方法。

背景技術(shù)：

1、葉蠟是覆蓋在植物角質(zhì)層表面的一層蠟質(zhì)，其主要成分為各種脂類(lèi)化合物，包括烷烴類(lèi)、脂肪醇、脂肪酸、醛類(lèi)、蠟酯等。植物表皮的蠟質(zhì)形成及其成分變化通常是植物適應(yīng)外界環(huán)境的結(jié)果，包括對(duì)極端環(huán)境條件如異常溫度、干旱、高鹽度等反應(yīng)。葉蠟脂類(lèi)化合物在自然界具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分布廣泛等特點(diǎn)。因此，葉蠟脂類(lèi)化合物被視為指示氣候環(huán)境變化的重要生物標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于物源信息區(qū)分、古氣候重建及古環(huán)境研究中。

2、其中，烷烴類(lèi)化合物中的正構(gòu)烷烴因其來(lái)源的專(zhuān)一性與代表性，通常利用不同碳鏈長(zhǎng)度的正構(gòu)烷烴在沉積物中的分布特征來(lái)分析和表征有機(jī)質(zhì)的來(lái)源，以揭示氣候和環(huán)境的變化趨勢(shì)；酮類(lèi)化合物中長(zhǎng)鏈烯酮的組成變化可用于指示表層水體溫度的變化；脂肪酸類(lèi)化合物的主峰碳及分布特征在指示有機(jī)質(zhì)來(lái)源具有重要意義，此外，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值還可以反映溫度的相對(duì)變化；脂肪醇類(lèi)化合物中的甾醇分子結(jié)構(gòu)差異則反映不同生物來(lái)源，可用于指示海洋與陸地生物有關(guān)的有機(jī)物質(zhì)輸入。因此，科學(xué)、有效地分離植物或沉積物葉蠟中的各類(lèi)脂類(lèi)生物標(biāo)志物，對(duì)于更精確區(qū)分物源信息和重建古環(huán)境具有重要的意義。

3、目前在有機(jī)地球化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，通常是采用皂化、萃取、柱層析分離的方法對(duì)葉蠟中的脂類(lèi)化合物進(jìn)行分離(如圖1所示)。然而，現(xiàn)有的方法在實(shí)際操作過(guò)程中存在一定的局限：(1)短鏈烷烴損失：皂化加熱過(guò)程中，短鏈烷烴類(lèi)化合物因揮發(fā)性較高容易損失，導(dǎo)致其后續(xù)的定量分析結(jié)果出現(xiàn)偏差，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；(2)組分交叉干擾：在萃取過(guò)程中，脂肪酸類(lèi)化合物易與其他組分混合進(jìn)入目標(biāo)組分中，使得后續(xù)分離的脂肪醇組分中含有脂肪酸殘留，導(dǎo)致化合物的純度降低；(3)分離效率不足：在傳統(tǒng)硅膠柱層析中，不同組分的極性差異較大，可能導(dǎo)致組分洗脫的不完全分離，難以獲得高純度的目標(biāo)化合物。因此，傳統(tǒng)的分離方法在分離烷烴、脂肪酸、酮和脂肪醇類(lèi)等多類(lèi)生物標(biāo)志物化合物的時(shí)候難以獲得相對(duì)純凈的各族組分，且烷烴類(lèi)化合物損失較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種葉蠟脂類(lèi)化合物族組分分離方法，以獲得高純度的各族脂類(lèi)化合物，并顯著減少烷烴組分的損失，從而提高分離的精確性和效率。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、一種葉蠟脂類(lèi)化合物族組分分離方法，包括以下步驟：

4、步驟1.將樣品經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，使用有機(jī)溶劑提取出總脂，得到總脂(tles)提取液；

5、步驟2.使用層析硅膠分離所述總脂提取液，通過(guò)使用不同的有機(jī)溶劑洗脫，分別得到烷烴(hdy)組分和極性組分1；

6、步驟3.對(duì)所述極性組分1進(jìn)行皂化處理，得到皂化反應(yīng)液；

7、步驟4.向所述皂化反應(yīng)液中加入飽和氯化鈉溶液，之后酸化至ph＜3；

8、步驟5.向步驟4酸化后的樣品中加入正己烷進(jìn)行液液萃取，收集上清液；

9、步驟6.使用氨丙基硅膠分離所述上清液，通過(guò)使用不同的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，分別得到中性(ne)組分、酸性(fa)組分和極性組分2；

10、步驟7.使用層析硅膠分離所述中性組分，通過(guò)使用不同的有機(jī)溶劑洗脫，分別得到酮醛類(lèi)化合物、醇類(lèi)化合物和極性組分3。

11、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述樣品為植物葉片或植物葉片沉積物；所述預(yù)處理為：將樣品依次進(jìn)行干燥、研磨、過(guò)篩。

12、本發(fā)明對(duì)干燥、研磨、過(guò)篩的條件不做特別限定，選用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段即可，例如：冷凍干燥、研磨、過(guò)100目篩。

13、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，使用有機(jī)溶劑提取出總脂的方法為萃取法或抽提法，使用的有機(jī)溶劑為二氯甲烷和甲醇。

14、本發(fā)明對(duì)萃取法或抽提法的具體參數(shù)、步驟不做特殊要求，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段。

15、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述步驟2中，選用有機(jī)溶劑為正己烷時(shí)，洗脫得到烷烴組分，選用有機(jī)溶劑為體積比1:3二氯甲烷和甲醇的混合溶劑時(shí)，洗脫得到極性組分1。

16、本發(fā)明中，洗脫出的烷烴組分濃縮后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中可直接進(jìn)行氣相色譜分析。

17、本發(fā)明基于極性差異，先用正己烷進(jìn)行洗脫，洗脫出烷烴類(lèi)化合物，再用體積比1:3二氯甲烷和甲醇的混合溶劑進(jìn)行洗脫，洗脫出極性組分。

18、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述皂化處理的步驟為：向所述極性組分1中加入koh溶液和水，在80℃下加熱皂化2小時(shí)。

19、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述koh溶液的濃度為1mol/l。

20、本發(fā)明對(duì)極性組分1、koh溶液和水的體積比不做特殊限定，用量能夠使得極性組分1充分進(jìn)行皂化反應(yīng)即可。

21、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，酸化至ph﹤3所用的酸液為4mol/lhcl溶液。

22、本發(fā)明對(duì)于飽和氯化鈉溶液的用量不做特殊限定，選用本領(lǐng)域常用的能夠促進(jìn)有機(jī)相和水相的分離，減少乳化現(xiàn)象，以及促進(jìn)脂肪酸提取的用量即可。

23、本發(fā)明對(duì)于所述步驟5的液液萃取的次數(shù)不做特殊限定，可進(jìn)行多次液液萃取，直至最后兩次正己烷萃取液為無(wú)色為止。

24、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述步驟6中，選用有機(jī)溶劑為體積比3:1的二氯甲烷和異丙醇的混合溶劑時(shí)，洗脫得到中性組分，選用有機(jī)溶劑為濃度為4％v/v乙酸乙醚溶液時(shí)，洗脫得到酸性組分，選用有機(jī)溶劑為甲醇時(shí)，洗脫得到極性組分2。

25、本發(fā)明利用洗脫液的極性不同，先使用體積比3:1的二氯甲烷和異丙醇的混合溶劑洗脫出中性組分，再使用濃度為4％v/v乙酸乙醚溶液洗脫出酸性組分，最后使用甲醇洗脫出極性組分。基于化合物的極性逐漸增加的原則，從非極性到極性，逐步洗脫不同極性的化合物，這樣的順序可以確保不同極性的化合物被有效地分離。

26、在本發(fā)明中，洗脫出酸性組分后，將所述酸性組分濃縮至近干，之后加入二氯甲烷和甲醇的鹽酸溶液進(jìn)行衍生化，衍生化后加入正己烷提取上清液，重復(fù)正己烷的提取步驟直至最后的兩次正己烷沖洗液無(wú)色，將上清液收集于新樣品瓶中，待氣相色譜質(zhì)譜分析。

27、在本發(fā)明一些實(shí)施方式，所述甲醇的鹽酸溶液中，鹽酸和甲醇的體積比為5:95；所述二氯甲烷和甲醇的鹽酸溶液的體積比為1:1；所述衍生化的反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間為2h。

28、本發(fā)明對(duì)于二氯甲烷、甲醇的鹽酸溶液的用量不做特殊限定，選用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的能夠使酸性組分進(jìn)行衍生化的用量即可，例如：100μl。

29、在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，所述步驟7中，選用有機(jī)溶劑為體積比1:1的正己烷和二氯甲烷的混合溶劑時(shí)，洗脫得到酮醛類(lèi)化合物，選用有機(jī)溶劑為體積比4:1的正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑時(shí)，洗脫得到醇類(lèi)化合物，選用有機(jī)溶劑為甲醇時(shí)，洗脫得到極性組分3。

30、本發(fā)明利用洗脫液的極性不同，先使用體積比1:1的正己烷和二氯甲烷的混合溶劑洗脫出酮醛類(lèi)化合物，再使用體積比4:1的正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑洗脫出醇類(lèi)化合物，最后使用甲醇洗脫出極性組分3?；诨衔锏臉O性逐漸增加的原則，從非極性到極性，逐步洗脫不同極性的化合物，這樣的順序可以確保不同極性的化合物被有效地分離。

31、洗脫完成后，本發(fā)明將酮醛類(lèi)化合物濃縮并轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，直接用于氣相色譜質(zhì)譜分析；醇類(lèi)化合物濃縮至近干后，加入100μl二氯甲烷和100μl雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生化試劑，在70℃的溫度條件下衍生化1小時(shí)。衍生化完成后，定容，待進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。

32、本發(fā)明對(duì)于上述濃縮的方式不做特殊限定，選用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段即可，例如：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或氮?dú)獯祾摺?/p>

33、本發(fā)明對(duì)于上述洗脫過(guò)程中，洗脫液的用量不做特殊限定，選用本領(lǐng)域進(jìn)行化合物洗脫常用的洗脫液的用量即可。

34、本發(fā)明中進(jìn)行上述氣相色譜質(zhì)譜分析的方法、參數(shù)均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，不作為本發(fā)明保護(hù)的技術(shù)方案。

35、本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)效果：

36、本發(fā)明提供的方法有效避免了正構(gòu)烷烴在皂化加熱過(guò)程中的損失，顯著提高了烷烴類(lèi)化合物的回收率。同時(shí)，本方法分離所得的醇類(lèi)和酸性化合物純凈度較高，雜質(zhì)較少。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)方案的優(yōu)化，本發(fā)明能夠科學(xué)、高效地實(shí)現(xiàn)醇類(lèi)與酸性化合物的分離，并確保烷烴類(lèi)化合物在分離過(guò)程中的穩(wěn)定性和完整性。