本發(fā)明涉及包括至少一種式(i)的抗原的新穎免疫原性化合物、特別是式(ii)的免疫原性化合物及其作為藥物、特別是作為疫苗的用途。本發(fā)明也涉及包含中間體的相關(guān)方面以及制備免疫原性化合物的方法。此外，本發(fā)明涉及包括免疫原性化合物的藥物組合物以及式(i)的抗原在生物測(cè)定中的用途。
背景技術(shù)：
1、肺炎克雷伯菌(klebsiella.pneumoniae或k.pneumoniae)是革蘭氏陰性、兼性厭氧、棒形細(xì)菌，其主要定殖呼吸道、腸道及泌尿道以及皮膚上并導(dǎo)致肺炎克雷伯菌感染(kpi)。該細(xì)菌主要充當(dāng)機(jī)會(huì)性病原體。kpi是院內(nèi)感染的主要病因，其主要影響免疫功能不全患者。由于出現(xiàn)了對(duì)幾乎所有可用抗微生物劑皆有抗性的菌株及其全世界散播，故由肺炎克雷伯菌引起的感染是健康護(hù)理環(huán)境中的重要挑戰(zhàn)。由肺炎克雷伯菌引起的感染可造成高發(fā)病率及死亡率。因此，極其期望預(yù)防由肺炎克雷伯菌引起的感染，且疫苗接種是對(duì)抗kpi的最成本有效及最有力的手段。
2、肺炎克雷伯菌是囊封細(xì)菌，在其外膜上表達(dá)有助于該物種的毒力的脂質(zhì)多糖(lps)及莢膜多糖(cps,k-抗原)。
3、lps由三種組分組成，即用作膜錨著點(diǎn)的脂質(zhì)a部分、共價(jià)鍵結(jié)至脂質(zhì)a的核心寡糖及共價(jià)鍵結(jié)至核心寡糖的包括形成o-抗原的重復(fù)糖單元的末端抗原多糖。已證實(shí)，經(jīng)提取lps是熱原性的、有毒的且能夠?qū)е陆M織損害。lps可由cps所掩蓋且通常比cps更少暴露在表面上。
4、cps包括在細(xì)菌外表面上形成一層的重復(fù)糖單元。cps通常是復(fù)雜的、直鏈或具支鏈，并具有比lps更大的分子量。其高免疫原性及表面暴露使其成為疫苗接種策略的令人感興趣的靶標(biāo)。例如，wo2016156338公開(kāi)了與碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌cps相關(guān)的合成寡糖的結(jié)合物。
5、然而，克雷白氏菌屬cps的變異性較高。在血清學(xué)上已鑒別出超過(guò)77種不同cps類(lèi)型(所謂的k-類(lèi)型、k-血清型或k-抗原)，但存在至少141種k-類(lèi)型。這些額外k-類(lèi)型是基于cps-基因座或k-基因座來(lái)鑒別且稱(chēng)為kl系列。
6、另一方面，lps的變異性較低且當(dāng)前已知的所謂的o-類(lèi)型、o-血清型或o-抗原限于以下11個(gè)主群：o1、o2a(之前稱(chēng)為gal-i)、o2ac、o2afg(之前稱(chēng)為gal-iii)、o2aeh(先前o9)、o3(包含亞血清型o3、o3a及o3b)、o4、o5、o7、o8及o12。除上述類(lèi)型外，基于稱(chēng)為ol系列的o-基因座已報(bào)道11種額外o-類(lèi)型。雖然o-抗原的免疫原性低于k-抗原且暴露在膜表面的程度較低，但也考慮將其用于疫苗接種策略。在最近一項(xiàng)調(diào)查中，一大批臨床分離株、尤其多重耐藥分離株確定了cps及l(fā)ps血清型的相對(duì)盛行率(例如lam等人，microbial?genomics2022；8:000800；doi?10.1099/mgen.0.000800)。
7、通過(guò)諸多多重耐藥的肺炎克雷伯菌菌株(例如st258)產(chǎn)生o-類(lèi)型o2afg。這些菌株在全球散播并極具藥物抗性(例如碳青霉烯抗性)。o2afg的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)例如公開(kāi)于kelly等人，j.of?bacteriol.,178(17),1996,5205-5214中：
8、
9、o-類(lèi)型o2a是臨床分離株中最常見(jiàn)的五種o-抗原之一?？股乜剐栽趏2a中也很常見(jiàn)。o2a的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)例如公開(kāi)于kelly等人，j.of?bacteriol.,178(17),1996,5205-5214中：
10、
11、o2afg血清型未由o2a-特異性抗體識(shí)別且反之亦然(szijarto等人，int?j?medmicrobiol?2016；306(2):89-98；pmid:26723873；http://dx.doi.org/10.1016/j.ijmm.2015.12.002)。
12、眾所周知，純分離的細(xì)菌多糖是胸腺獨(dú)立性抗原，其在無(wú)t細(xì)胞幫助下活化b細(xì)胞。因此，對(duì)碳水化合物的免疫反應(yīng)是原發(fā)性免疫反應(yīng)，其中抗體主要由低親和力igg組成，無(wú)親和力成熟/同型轉(zhuǎn)換且igg較不穩(wěn)健并短暫。典型胸腺獨(dú)立性抗原是例如來(lái)自肺炎鏈球菌(streptococcus?pneumoniae)、流感嗜血菌(haemophilus?influenzae)b型的cps。
13、為克服胸腺獨(dú)立性抗原的局限性，cps或lps的o-抗原可共價(jià)連接至載體蛋白上。使用這些多糖-蛋白結(jié)合物(糖結(jié)合物疫苗)的免疫引起t細(xì)胞依賴(lài)性b細(xì)胞活化并甚至在嬰兒身上也可誘導(dǎo)持久免疫性。例如，wo2019106201公開(kāi)了與肺炎克雷伯菌血清型o1、o2、o2ac及o8?o-多糖以及碳青霉烯抗性肺炎克雷伯菌st258?o-多糖相關(guān)的合成寡糖的結(jié)合物。
14、如何將結(jié)合物疫苗呈現(xiàn)至t細(xì)胞的潛在機(jī)制仍在爭(zhēng)論中。可通過(guò)濾泡b細(xì)胞的多糖-特異性b細(xì)胞受體(bcr)識(shí)別及內(nèi)化多糖-蛋白結(jié)合物。糖結(jié)合物的蛋白部分被處理并呈現(xiàn)在b細(xì)胞的細(xì)胞表面上的mhc-ii分子上。通過(guò)肽-特異性t細(xì)胞識(shí)別mhc-ii-肽復(fù)合物然后引起同源t細(xì)胞/b細(xì)胞相互作用，其中b細(xì)胞自t細(xì)胞接收活化信號(hào)。最新研究表明，在結(jié)合至bcr并隨后攝入核內(nèi)體中后，糖結(jié)合物也可處理成糖肽片段。然后肽部分可結(jié)合至mhc-ii分子，而碳水化合物(聚糖)暴露于t細(xì)胞受體，在此其可與碳水化合物-特異性cd4+t細(xì)胞相互作用。
15、在兩種不同合成聚糖抗原(例如聚糖“a”及聚糖“b”)共價(jià)鍵結(jié)至相同載體蛋白分子的情形下，現(xiàn)有聚糖“a”及聚糖“b”-特異性b細(xì)胞的數(shù)量及在這些b細(xì)胞上所表達(dá)的bcr的親和力決定聚糖-特異性抗體(ab)的生成。若例如針對(duì)聚糖“a”存在的b細(xì)胞的數(shù)量較少且在細(xì)胞表面上也表達(dá)低親和力bcr，則在疫苗接種后所誘導(dǎo)的ab反應(yīng)將由聚糖“b”-特異性ab支配。目前，無(wú)法預(yù)測(cè)糖結(jié)合物的免疫優(yōu)勢(shì)的出現(xiàn)及強(qiáng)度。
16、cps或lps是否或何者是用于疫苗的適宜候選者或模型序列仍是困難且無(wú)法預(yù)測(cè)的，且特別是無(wú)法預(yù)測(cè)較短寡糖是否或何者適于在活體內(nèi)生成期望免疫反應(yīng)。特別是，糖結(jié)合物的免疫優(yōu)勢(shì)仍是無(wú)法預(yù)測(cè)的問(wèn)題。
17、迄今為止，并無(wú)可用于肺炎克雷伯菌的經(jīng)批準(zhǔn)疫苗，這明確地證實(shí)了與這些疫苗的研發(fā)相關(guān)的挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，新寡糖-抗原作為對(duì)抗肺炎克雷伯菌的潛在疫苗具有改良性質(zhì)。由于其靶向多個(gè)血清型的特異性非天然雜合結(jié)構(gòu)，其能夠減少每次疫苗接種的載體蛋白的量，藉此減少不期望載體誘導(dǎo)的表位抑制，并同時(shí)減少制造成本。
1.一種免疫原性化合物，其包括至少一種具有式(i)結(jié)構(gòu)的寡糖雜合抗原
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中m是4，n是2且r是oh。
4.一種式(ii)的免疫原性化合物，
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中m是4，n是2且r是oh。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中該橋的該主鏈具有8至20個(gè)、優(yōu)選8至16個(gè)共價(jià)連接在一起的原子的長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度形成寡糖的還原端c1處的氧與載體蛋白crm197處賴(lài)氨酸殘基的氨基氮之間的最短距離。
9.根據(jù)權(quán)利要求4、5、6或8中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
10.根據(jù)權(quán)利要求4、5或6中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
11.根據(jù)權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中i是6至15，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其是選自由式(iia)、(iib)及(iic)的結(jié)構(gòu)組成的群：
13.一種藥物組合物，其包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及至少一種治療惰性賦形劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包括佐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用作藥學(xué)、特別是用作疫苗。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于預(yù)防和/或治療肺炎克雷伯菌感染。
17.一種多價(jià)疫苗，其包括根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
18.一種制備根據(jù)權(quán)利要求4至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物的中間體化合物，其具有式(iii)的結(jié)構(gòu)：
19.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求4至12中任一項(xiàng)所述的免疫原性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的中間體化合物，其具有式(iv)的結(jié)構(gòu)：