本技術(shù)涉及一種性激素的檢測試劑盒以及檢測方法，屬于物質(zhì)檢測。

背景技術(shù)：

1、性激素(化學(xué)本質(zhì)是脂質(zhì))是指由動物體的性腺，以及胎盤、腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶等組織合成的甾體激素，具有促進性器官成熟、副性征發(fā)育及維持性功能等作用。雌性動物卵巢主要分泌兩種性激素——雌激素與孕激素，雄性動物睪丸主要分泌以睪酮為主的雄激素。

2、性激素與女性健康息息相關(guān)，性激素分泌紊亂可能會導(dǎo)致女性產(chǎn)生多種內(nèi)分泌及代謝性疾病，例如一種重要生殖內(nèi)分泌疾病：多囊卵巢綜合征(簡稱pcos)，育齡婦女發(fā)病率達到5～10％，其臨床表現(xiàn)常為稀發(fā)、無排卵、雄激素過高、胰島素抵抗、卵巢多囊、肥胖和/或多毛等。其中雄激素過高可作為多囊卵巢綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)的一項重要指標(biāo)。因此，對女性性激素水平進行檢測有助于內(nèi)分泌及代謝性疾病的診斷，具有重要的臨床和研究價值。

3、目前性激素的檢測具有以下方法：

4、(1)免疫學(xué)方法：基于抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)，通過檢測抗體對性激素分子的識別進行檢測。免疫學(xué)方法憑借著自動化操作，檢測快速，成本低的優(yōu)勢成為目前臨床實驗常用的檢測方法，但是其容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)和假陽性等問題，而且一次實驗只能檢測一種性激素。另外，免疫學(xué)方法對水平較低的性激素檢測很不穩(wěn)定，例如對女性睪酮進行免疫學(xué)檢測時，濃度往往被高估2～5倍。

5、(2)氣相色譜質(zhì)譜法(gc-ms)同樣也可用于性激素的定量檢測，其特異性好，可實現(xiàn)多種性激素的同時檢測，但對于樣品的前處理過程要求比較苛刻，如提取、純化和衍生步驟導(dǎo)致整個前處理過程非常繁瑣，在臨床上開展的難度較大。

6、(3)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(lc-ms/ms)對性激素的檢測逐漸成為目前醫(yī)學(xué)檢測實驗室的重要選擇，其具備了靈敏度高、雜質(zhì)干擾少、可直接檢測和特異性高等優(yōu)勢。并且質(zhì)譜方法可以在短時間內(nèi)同時檢測多種性激素，相較于傳統(tǒng)免疫學(xué)方法每次只能檢測一種性激素而言，在疾病診斷時候具有更高的臨床應(yīng)用價值。但是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍然受到諸多限制，其中最主要的問題是前處理過程復(fù)雜，常需要多步驟固相萃取(spe)過程。現(xiàn)有技術(shù)提出了采用自動化酶聯(lián)免疫法進行樣品前處理，通過機械臂的轉(zhuǎn)移實現(xiàn)一站式完成spe加樣和移樣過程，但是該過程速度較慢，且需要多次進行離心、正壓等步驟吸附或脫附樣品，自動化程度較低。而采用人工手動操作完成spe的加樣和取樣步驟，對臨床操作人員技能要求較高，并且容易出現(xiàn)人為失誤。

7、綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中對性激素的檢測方法存在前處理過程復(fù)雜繁瑣，花費時間長，容易出現(xiàn)誤差問題導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確度差。并且女性性激素種類和分泌水平和男性有所不同，因此需要一種性激素的檢測方法，實現(xiàn)針對女性性激素水平進行準(zhǔn)確檢測，以促進對女性性激素相關(guān)疾病的診斷和研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于提供一種性激素的檢測試劑盒以及檢測方法，采用磁固相萃取填料與待測樣品中的性激素結(jié)合，通過磁吸附轉(zhuǎn)移實現(xiàn)性激素的富集純化，極大簡化了前處理的操作流程，操作簡便快捷，提取效率高，能夠同時對待測樣品中多種性激素進行高通量樣本檢測。

2、第一方面，本技術(shù)提供了一種性激素的檢測試劑盒，檢測試劑盒包括磁固相萃取填料、活化液、平衡液、淋洗液和洗脫液；磁固相萃取填料包括親水親脂磁性微球；親水親脂磁性微球包括聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架和式i所示的吡咯烷酮基團，吡咯烷酮基團接枝或鍵合在聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架上。本技術(shù)的檢測試劑盒采用親水親脂磁性微球作為磁固相萃取填料，親水親脂磁性微球通過親水基團(吡咯烷酮基團)和親脂基團(聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球中含有的苯基和乙烯基鍵合后形成的碳鏈)促進與性激素的結(jié)合，通過親水親脂平衡磁性微球?qū)π约に剡M行結(jié)合，可以配合磁吸附技術(shù)對性激素進行萃取富集。萃取性激素后可以配合淋洗液和洗脫液對其進行凈化除雜，保證后續(xù)測定的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測的前處理流程工藝簡單，花費時間少，可以配合磁固相萃取自動化處理系統(tǒng)，從而有利于性激素的快速準(zhǔn)確檢測，提升性激素的檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，有利于對以性激素為標(biāo)志物的相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后評估等應(yīng)用。

3、本技術(shù)中吡咯烷酮基團如式i：所示，由α-吡咯烷酮分子脫去n原子上的氫原子得到。

4、吡咯烷酮基團可以接枝或鍵合在聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架上，接枝或鍵合后吡咯烷酮基團均以功能性基團的形式結(jié)合在聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架上。本技術(shù)中接枝是指在制備得到聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架后，將吡咯烷酮基團活化后與聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架通過化學(xué)反應(yīng)進行結(jié)合；鍵合是指在聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架的制備過程中，將吡咯烷酮基團加入含聚合單體的反應(yīng)體系中共同反應(yīng)生成親水親脂磁性微球。

5、優(yōu)選地，親水親脂磁性微球中，吡咯烷酮基團和聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架的摩爾比例為(9～15):(8～12)。通過控制親水親脂磁性微球中親水基團和親脂基團的適宜比例，使其與多種性激素的極性和非極性基團配合，從而對性激素具有更強的結(jié)合能力，有利于提高磁性微球?qū)π约に氐妮腿⌒Ч?/p>

6、進一步地，親水親脂磁性微球中，吡咯烷酮基團和聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架的摩爾比例為(13～15):(8～10)。進一步控制親水基團和親脂基團的比例，能夠使親水親脂磁性微球與血液樣品中的七種性激素均表現(xiàn)出優(yōu)異的結(jié)合效果，并且結(jié)合的特異性更高，減少對非目標(biāo)雜質(zhì)的萃取，提高萃取效率和準(zhǔn)確性，滿足臨床上對七種性激素檢測的需求。

7、優(yōu)選地，聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架通過包括以下步驟的制備方法得到：將苯乙烯和二乙烯基苯，在含有引發(fā)劑、致孔劑和聚乙二醇修飾的磁性粒子的反應(yīng)體系中，進行交聯(lián)聚合反應(yīng)，即得聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架。本技術(shù)在交聯(lián)聚合反應(yīng)過程中引入磁性粒子，與聚苯乙烯-二乙烯基苯基體鍵合得到高分子磁性微球，在磁場下具備磁性，同時具有聚苯乙烯-二乙烯基苯的吸附性能，能夠適用于酸性、堿性和/或中性化合物的萃取和凈化。

8、優(yōu)選地，引發(fā)劑包括偶氮二異丁腈和/或過氧化苯甲酰；致孔劑可選自甲苯、液體石蠟、鄰苯二甲酸二丁酯中的至少一種；本技術(shù)中交聯(lián)聚合反應(yīng)的反應(yīng)體系為乙醇水溶液體系。

9、優(yōu)選地，磁性粒子包括鐵粒子、鈷粒子、鎳粒子、四氧化三鐵粒子中的至少一種。

10、本技術(shù)中聚乙二醇修飾的四氧化三鐵粒子采用包括以下步驟的制備方法得到：將亞鐵鹽、鐵鹽、還原劑和聚乙二醇混合后，加入沉淀劑進行共沉淀處理，即得聚乙二醇修飾的四氧化三鐵粒子。

11、優(yōu)選地，在進行交聯(lián)聚合反應(yīng)時，苯乙烯和二乙烯基苯的摩爾比例為(0.5～9):(1～10)。具體地，交聯(lián)聚合反應(yīng)的條件包括：交聯(lián)聚合反應(yīng)的溫度為40～80℃；交聯(lián)聚合反應(yīng)的時間為6～24h。本技術(shù)通過控制苯乙烯和二乙烯基苯反應(yīng)物的比例及反應(yīng)條件，控制聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球中苯環(huán)和交聯(lián)碳鏈的數(shù)量，進而控制親水親脂磁性微球的極性，使其更好地結(jié)合性激素，減少與非目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合，提高磁固相萃取的萃取效果。

12、為進一步提高親水親脂磁性微球與性激素的結(jié)合效果，使磁性微球基體能夠更好地與親水基團配合，在進行交聯(lián)聚合反應(yīng)時，苯乙烯和二乙烯基苯的摩爾比例為(0.5～5):(6～10)。

13、可選地，親水親脂磁性微球通過包括以下步驟的制備方法得到：將聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架進行氯甲基化處理，然后加入吡咯烷酮進行修飾，即得親水親脂磁性微球。該親水親脂磁性微球包括聚苯乙烯-二乙烯基苯磁性微球骨架和骨架上接枝的吡咯烷酮基團。

14、優(yōu)選地，親水親脂磁性微球的平均粒徑為1～50um。本技術(shù)的親水親脂磁性微球的平均粒徑在1～50um范圍內(nèi)，采用平均粒徑為1～5um的小顆粒親水親脂磁性微球和平均粒徑為30～50um的大顆粒親水親脂磁性微球均能實現(xiàn)與性激素較好的結(jié)合。

15、優(yōu)選地，淋洗液包括第一淋洗液和第二淋洗液；第一淋洗液包括腈類化合物和水，第一淋洗液中腈類化合物和水的體積比例為(5～15):(60～90)；和/或，第二淋洗液包括腈類化合物和脂肪烴類化合物，第二淋洗液中腈類化合物與脂肪烴類化合物的體積比例為(10～50):(30～90)。本技術(shù)通過第一淋洗液去除磁固相萃取填料在性激素萃取步驟中，共萃取到的極性相對于性激素較強的一部分雜質(zhì)；通過第二淋洗液去除磁固相萃取填料在性激素萃取步驟中，共萃取到的非極性相對于性激素更強的一部分雜質(zhì)。通過兩步淋洗配合進行凈化除雜，能夠最大限度地除去共萃取到的雜質(zhì)，使最終得到的性激素待測樣品更干凈，減少雜質(zhì)在后續(xù)檢測中帶來的干擾，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

16、優(yōu)選地，腈類化合物選自乙腈、丙腈、丙烯腈中的至少一種；和/或，脂肪烴類化合物選自c5～15的脂肪烴類化合物中的至少一種，本技術(shù)中脂肪烴類化合物包括烷烴和/或烯烴。

17、進一步地，脂肪烴類化合物選自c6～10的烷烴類化合物中的至少一種，例如正己烷、正庚烷等。

18、優(yōu)選地，活化液包括腈類化合物和水，活化液中腈類化合物和水的體積比例為(40～90):(10～50)。本技術(shù)在萃取待測樣品中的性激素之前，采用活化液對磁固相萃取填料進行活化，通過腈類化合物和水的混合液可以浸潤磁固相萃取填料本身，清洗填料中可能存在的微量雜質(zhì)，同時還可以起到讓磁固相萃取填料具備更好的吸附效果的作用。

19、優(yōu)選地，平衡液包括腈類化合物和水，平衡液中腈類化合物和水的體積比例為(5～30):(60～90)。本技術(shù)將磁固相萃取填料保存在平衡液中，不止起到保存的作用，同時在萃取待測樣品中性激素之前，還起到平衡磁固相萃取填料本身溶劑體系的作用，更適用于在下一步萃取步驟中實現(xiàn)高的萃取效率。

20、優(yōu)選地，洗脫液包括腈類化合物和水，洗脫液中腈類化合物和水的體積比例為(50～100):(3～25)。磁固相萃取填料經(jīng)過淋洗步驟后，本技術(shù)通過磁固相萃取填料中的親水親脂磁性微球?qū)⑿约に剡M行萃取和凈化，然后通過洗脫液實現(xiàn)性激素的解吸附，使性激素得到釋放的同時，通過洗脫液將性激素轉(zhuǎn)換成溶液形式，有利于后續(xù)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接進行分析測試。

21、優(yōu)選地，性激素包括睪酮(縮寫：t)、雄烯二酮(縮寫：a4)、脫氫表雄酮(縮寫：dhea)、硫酸脫氫表雄酮(縮寫：dhea-s)、17α-羥孕酮(縮寫：17α-ohp)、孕酮(縮寫：p)、雙氫睪酮(縮寫：dht)中的至少一種。上述七種性激素可作為性激素相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物，其在血液樣本具有較大的含量差異。尤其是對于女性血液樣本，例如睪酮和雙氫睪酮在女性血液樣本中含量極低，僅有0.05～6ng/ml，而像硫酸脫氫表雄酮可達到50～6000ng/ml。臨床上采用免疫發(fā)光法檢測試劑，一次實驗僅能針對其中一種性激素進行檢測，并且對含量較低的性激素還具有檢測準(zhǔn)確度差的問題。本技術(shù)的檢測試劑盒可實現(xiàn)對上述七種性激素進行快速萃取和凈化，配合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確檢測。

22、進一步地，性激素包括睪酮、雄烯二酮、脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、17α-羥孕酮、孕酮和雙氫睪酮。本技術(shù)的性激素的檢測試劑盒可以同時對檢測樣本中的七種性激素進行檢測，而且具有檢測效率高，準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢。

23、第二方面，本技術(shù)提供了一種采用上述任意一種性激素的檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：s100、將磁固相萃取填料依次進行活化處理、平衡處理后，加入待測樣品中進行萃取處理，其中，待測樣品中含有性激素；s200、萃取處理后將磁固相萃取填料利用淋洗液進行淋洗處理，然后采用洗脫液進行洗脫處理，得到待測液；s300、對待測液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，獲取待測樣品中性激素的濃度信息。本技術(shù)采用磁固相萃取填料結(jié)合待測樣品中的性激素，通過外加磁場將性激素從待測樣品中分離，配合淋洗和洗脫步驟去除雜質(zhì)，得到含性激素的待測液，實現(xiàn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的前處理過程。方法所需實驗流程簡單高效，通過本技術(shù)的磁固相萃取填料中的親水親脂磁性微球能夠?qū)哿康男约に剡M行高倍富集，并且保證性激素與待測樣品基體徹底分離，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

24、本技術(shù)的檢測方法還可以配合磁固相萃取自動化處理系統(tǒng)進行，將檢測試劑盒各組分分別置于不同容器中(例如96孔板)，利用外加磁場將磁固相萃取填料在不同液體體系之間進行轉(zhuǎn)移，自動化實現(xiàn)上述活化、平衡、萃取、淋洗和洗脫過程，解放人力，還有利于減少人工操作的誤差。

25、本技術(shù)的檢測方法中淋洗還可以包括第一次淋洗和第二次淋洗，本技術(shù)中活化、平衡、第一次淋洗、第二次淋洗和洗脫的時間可以為20～60s，優(yōu)選地，活化、平衡、第一次淋洗和第二次淋洗的時間為20～30s。本技術(shù)中萃取處理的時間可以為60～90s。活化、平衡、第一次淋洗、第二次淋洗和洗脫的每一步驟后，通過外加磁場轉(zhuǎn)移磁固相萃取填料的移磁步驟時間可以為20～30s。

26、優(yōu)選地，步驟s100還包括：萃取處理前，向待測樣品中加入醇類化合物進行除雜和分離處理。血液樣品中部分性激素會與球蛋白和/或白蛋白進行結(jié)合，會阻礙性激素與磁固相萃取填料的結(jié)合，從而影響性激素檢測的準(zhǔn)確性。本技術(shù)針對女性血液樣品中存在的影響性激素檢測的干擾雜質(zhì)，采用醇類化合物破壞血液樣品中的蛋白結(jié)構(gòu)，使性激素從與蛋白質(zhì)的結(jié)合中釋放出來，另外醇類化合物還可以與血液樣品中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子反應(yīng)進行除雜，減少或避免大分子雜質(zhì)對磁固相萃取過程的影響，提高磁固相萃取效果。本技術(shù)的磁固相萃取填料在活化平衡后，可以直接加入除雜和分離處理后的液體體系中進行磁固相萃取處理，相比與傳統(tǒng)固相萃取大大簡化了操作流程，有利于提高萃取效率。

27、為進一步提高除雜和分離處理的效果，向待測樣品中加入醇類化合物進行除雜和分離處理包括：醇類化合物選自c1～6的醇類化合物中的至少一種，例如甲醇、乙醇、異丙醇和乙二醇等。本技術(shù)采用c1～6的醇類化合物，可以針對女性血液樣品中的大分子雜質(zhì)進行針對性的除雜并將性激素與蛋白大分子分離，使性激素得到充分釋放，有利于后續(xù)親水親脂磁性微球的分離，從而提高對女性血液樣品中性激素檢測的效率和準(zhǔn)確性。

28、本技術(shù)中進行除雜和分離處理的醇類化合物可以作為除雜劑，被包括在性激素的檢測試劑盒中。

29、優(yōu)選地，除雜和分離處理中，待測樣品與醇類化合物的體積比例為1:(1.5～3)。

30、優(yōu)選地，除雜和分離處理的時間為30～90s。

31、本技術(shù)中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件包括：

32、液相色譜條件包括：色譜柱為c18色譜柱；流動相a相為nh4f的去離子水溶液，流動相b相為nh4f的甲醇溶液；流速為0.4ml/min；柱溫為50℃；進樣量為10ul；

33、質(zhì)譜條件包括：使用電噴霧離子源，正負離子同時監(jiān)測模式，多重反應(yīng)監(jiān)測進行掃描；離子源溫度150℃，毛細管電壓capillary：2kv，脫溶劑氣溫度desolvation?temp：500℃，脫溶劑氣desolvation：1000l/hr，錐孔氣cone：150l/hr。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(mrm)進行掃描。

34、本技術(shù)所提供的性激素的檢測試劑盒以及檢測方法，具有以下有益效果：

35、1)本技術(shù)通過親水親脂磁性微球與性激素進行緊密結(jié)合，利用磁固相萃取技術(shù)能夠快速有效地萃取血液樣本中的性激素，通過磁場的作用力下實現(xiàn)性激素在淋洗液和洗脫液之間的轉(zhuǎn)移，對性激素進行凈化除雜，步驟簡潔，還可以配合磁固相萃取自動化處理系統(tǒng)，進一步簡化人工操作和減少人為誤差，提高性激素檢測的準(zhǔn)確性；

36、2)通過前處理的兩步淋洗步驟配合，能夠盡可能去除雜質(zhì)干擾物，降低雜質(zhì)干擾物對性激素分析測試的影響，配合洗脫步驟使性激素與磁固相萃取填料徹底分離，從而提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和測試靈敏度；

37、3)傳統(tǒng)蛋白沉淀與固相萃取過程所需的操作時長為2～3h，本技術(shù)的檢測方法針對女性血液樣品優(yōu)化了除雜和分離處理的條件，采用醇類化合物能夠快速徹底地除去大分子雜質(zhì)，并充分暴露待測性激素；配合磁固相萃取技術(shù)，能夠直接加入除雜和分離處理后的體系中，并在90s內(nèi)完成性激素的富集，將前處理的總操作時長縮短到9min以內(nèi)，極大的提高了性激素檢測的效率，并且具有準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點，能夠滿足批間精密度＜15％，批內(nèi)精密度＜15％，以及準(zhǔn)確度＜15％，有利于對以性激素為標(biāo)志物的相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后評估等應(yīng)用。