本發(fā)明涉及生物，特別是一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離試劑及方法。
背景技術(shù)：
1、細(xì)胞外囊泡（extracellular?vesicles,?evs）是幾乎所有細(xì)胞均可分泌的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，在眾多病理生理過程中發(fā)揮重要作用。evs分布廣泛，在血液、尿液和唾液等生物體液中均存在，成為疾病生物標(biāo)志物的重要來源，其中，尿細(xì)胞外囊泡（urinaryextracellular?vesicles，uevs)因其采集的無創(chuàng)性以及攜帶的豐富的內(nèi)容物信息，在疾病生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。
2、uevs特異膜蛋白的表達(dá)富含豐富的疾病信息，不僅有助于深入了解uevs的分泌和分選機(jī)制，還有助于各種疾病標(biāo)志物的篩選，而在uevs膜蛋白進(jìn)行檢測(cè)前，需要對(duì)uevs進(jìn)行分離，目前最主要使用的方法是超速離心法，但是尿液中的蛋白質(zhì)豐度跨越五個(gè)數(shù)量級(jí)，包括含量最高的tamm-horsfall?蛋白（thp）、白蛋白和其他20種血清過濾蛋白，在超速離心的過程中，thp會(huì)在尿液中聚合成幾微米長(zhǎng)的雙螺旋繩索樣結(jié)構(gòu)，將很多uevs包裹其中，在分離時(shí)與uevs一起沉淀下來，影響所得的uevs的純度，并且多聚體的包裹降低uevs的產(chǎn)量，限制uevs的臨床應(yīng)用前景，分離效率較低，影響后續(xù)的檢測(cè)工作，影響免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提出一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離試劑及方法，解決目前尿液細(xì)胞外囊泡分離時(shí)，分離效率低且產(chǎn)量低，影響后續(xù)免疫檢測(cè)的問題。
2、為達(dá)到此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
3、一種尿液分離試劑，按照質(zhì)量百分比計(jì)算，包括以下原料：0.2-0.4%的三乙醇胺、8-12%的蔗糖和余量蒸餾水。
4、一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，包括以下步驟：
5、步驟（1）：取尿液樣本，第一次離心，保留上清液；
6、步驟（2）：取步驟（1）所得的上清液，在室溫條件下進(jìn)行第二次離心，保留上清液s1和沉淀；
7、步驟（3）：將步驟（2）所得的沉淀與上述的尿液分離試劑混合，進(jìn)行孵育后，進(jìn)行第三次離心，保留上清液s2和沉淀p1；
8、步驟（4）：將上清液s1和上清液s2混合均勻，得到含有uevs的尿液上清；
9、所述第一次離心、第二次離心和第三次離心的離心力皆小于100000g。
10、優(yōu)選地，步驟（3）中，孵育的條件為室溫下振蕩孵育30-60s。
11、優(yōu)選地，步驟（1）中，第一次離心的條件為4℃下，2000-4000g離心5-10分鐘。
12、優(yōu)選地，步驟（2）和步驟（3）中，第二次離心和第三次離心的條件為室溫下，16000-17000g離心15-20分鐘。
13、優(yōu)選地，步驟（4）中所得的尿液上清，稀釋后即可用于免疫檢測(cè)。
14、進(jìn)一步，免疫檢測(cè)的方法為免疫層析檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)。
15、進(jìn)一步，稀釋倍數(shù)為10-20倍。
16、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述尿液樣本為晨尿。
17、優(yōu)選地，分離所得的uevs用于區(qū)分糖尿病腎損傷或前列腺癌。
18、本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：
19、尿液分離試劑中包含三乙醇胺、蔗糖和蒸餾水，將尿液中的thp多聚體解離，釋放包裹于其中的uevs，有效提高分離所得的uevs的產(chǎn)量，并且該尿液分離試劑的反應(yīng)條件較為溫和，減少對(duì)分離所得的uevs的結(jié)構(gòu)的影響，提高分離效率，降低分離操作的難度。
1.一種尿液分離試劑，其特征在于，按照質(zhì)量百分比計(jì)算，包括以下原料：0.2-0.4%的三乙醇胺、8-12%的蔗糖和余量蒸餾水。
2.一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：步驟（3）中，孵育的條件為室溫下振蕩孵育30-60s。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：步驟（1）中，第一次離心的條件為4℃下，2000-4000g離心5-10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：步驟（2）和步驟（3）中，第二次離心和第三次離心的條件為室溫下，16000-17000g離心15-20分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：步驟（4）中所得的尿液上清，稀釋后即可用于免疫檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：免疫檢測(cè)的方法為免疫層析檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：稀釋倍數(shù)為10-20倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：步驟（1）中，所述尿液樣本為晨尿。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免超速離心的尿液細(xì)胞外囊泡的分離方法，其特征在于：分離所得的uevs用于區(qū)分糖尿病腎損傷或前列腺癌。