本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種弓形蟲弱毒株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、弓形蟲(toxoplasma?gondii)是一種廣泛傳播的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染包括人類在內(nèi)的所有溫血動物，引發(fā)弓形蟲病。該病原體通過攝入貓科動物糞便中的卵囊、食用未煮熟的感染肉類或母嬰垂直傳播等途徑感染宿主。對于免疫功能正常個(gè)體，感染多呈隱性或自限性；然而，在免疫缺陷患者(如艾滋病患者、器官移植受者)中，弓形蟲可激活潛伏感染并導(dǎo)致致命性腦炎。此外，孕婦感染可引發(fā)胎兒流產(chǎn)、死胎或先天性畸形，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前，全球范圍內(nèi)尚無針對弓形蟲病的理想疫苗，傳統(tǒng)減毒活疫苗因毒力返祖風(fēng)險(xiǎn)高、免疫保護(hù)效果有限等問題，難以滿足臨床需求。

2、巨噬細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的核心效應(yīng)細(xì)胞，在抗弓形蟲感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能包括吞噬病原體、分泌促炎因子(如ifn-γ、il-12、tnf-α)、激活th1型免疫應(yīng)答及促進(jìn)組織修復(fù)等。然而，弓形蟲通過分泌效應(yīng)蛋白(如mic蛋白家族)主動抑制宿主巨噬細(xì)胞的活化與殺傷功能，從而逃避免疫清除。其中，微線體黏附蛋白mic1和mic3是弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子，不僅介導(dǎo)蟲體與宿主細(xì)胞膜的黏附，還可干擾宿主免疫信號通路，削弱巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控能力。因此，雙敲蟲株δmic1δmic3一方面降低弓形蟲的細(xì)胞內(nèi)寄生能力以削弱其毒力，另一方面解除其對宿主免疫細(xì)胞的抑制作用，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗感染功能。

3、盡管基因編輯技術(shù)(如crispr-cas9)在弓形蟲減毒株構(gòu)建中取得了一定進(jìn)展，但現(xiàn)有研究多聚焦于單一基因敲除或隨機(jī)突變，存在毒力調(diào)控不精準(zhǔn)、免疫調(diào)控機(jī)制不明確等缺陷。例如，傳統(tǒng)減毒株(如δku80株)雖能降低致病性，但其免疫激活效果不足，難以誘導(dǎo)長效保護(hù)性免疫。此外，部分基因編輯策略可能破壞弓形蟲必需基因，導(dǎo)致蟲株難以穩(wěn)定傳代。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提出了一種弓形蟲弱毒株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，基于crispr-cas9技術(shù)構(gòu)建的δmic1δmic3雙基因敲除弱毒株，通過特異性靶向mic1/mic3黏附蛋白基因，在降低蟲體入侵能力的同時(shí)，顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性、促炎因子分泌及th1型免疫應(yīng)答激活能力，為開發(fā)安全高效弓形蟲病預(yù)防與治療策略提供了新思路。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種弓形蟲弱毒株，缺失mic1基因和mic3基因。

4、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步地，所述mic1基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述mic1基因的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步地，所述mic3基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述mic3基因的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

6、seq?id?no.1mic1基因的核苷酸序列(5’-3’)：

7、atgggccaggcgctgtttctcaccgttctattgccggtgttatttggcgttgggccagaagcatatggagaagcgtcgcattctcattcgccggcatcgggacgttatatacaacagatgcttgaccaacgctgccaagagattgctgcagaactctgccaaagcggacttcgtaaaatgtgtgtgccctctagccggatagtagctcgaaacgccgtgggcattactcatcaaaatacacttcaatggagatgctttgatacagcctctttgctggagagcaatcaagaaaacaacggtgttaattgcgtggacgactgtggccacacgataccgtgtcctggcggcgtacaccggcaaaacagtaatcacgcaacgcgccatgagatactgtccaaattggtcgaagaaggagtacaacggttctgcagtccttatcaagcatctgccaacaagtactgtaacgacaaatttccagggaccattgcgaggaggtcgaagggtttcggaaacaatgtcgaggttgcgtggaggtgttacgagaaggccagcttgctgtactcggtttatgctgagtgtgcgagcaactgcggaacaacgtggtactgccctggaggacgacgagggacgtcgacagaactagacaagcggcattatacagaagaggaaggaattcgccaggcaatcggatccgtcgacagcccatgttctgaagttgaagtctgcctaccgaaggatgagaatcccccgctgtgtttagatgaaagtggccagatttcacgaactggtggtgggccaccgtcacaaccgcctgagatgcaacagcccgccgatcgttcggacgagagaggtggcggtaaggaacagtcgcctggaggagaagctcagccggaccatccaacgaagggtggtaacatagacctgcctgagaaatcaacatctcccgagaagacgccgaaaaccgagatccatggtgacagcacgaaagcgacgctcgaagaggggcagcaactaacgctcacgtttatctccactaaactggatgttgctgtaggctcgtgtcattcactcgtcgcgaatttccttgatggatttttgaagtttcagacgggctcaaattcggcgttcgatgtggtagaagtggaagagccagcaggacccgcagtgcttacgataggtctgggacacaaaggccgtctcgctgttgtcctcgactacaccaggctcaatgctgctttaggatcagctgcttacgtggtcgaagattctggatgcagctcaagtgaagaggttagtttccaaggagtgggtagtggagcgacgctcgtggtgacgacgcttggcgagagtcctacggccgtctctgcttga。

8、seq?id?no.2mic1基因的氨基酸序列(5’-3’)：

9、mgqalfltvllpvlfgvgpeaygeashshspasgryiqqmldqrcqeiaaelcqsglrkmcvpssrivarnavgithqntlqwrcfdtasllesnqenngvncvddcghtipcpggvhrqnsnhatrheilsklveegvqrfcspyqasankycndkfpgtiarrskgfgnnvevawrcyekasllysvyaecasncgttwycpggrrgtsteldkrhyteeegirqaigsvdspcsevevclpkdenpplcldesgqisrtgggppsqppemqqpadrsdergggkeqspggeaqpdhptkggnidlpekstspektpkteihgdstkatleegqqltltfistkldvavgschslvanfldgflkfqtgsnsafdvveveepagpavltiglghkgrlavvldytrlnaalgsaayvvedsgcssseevsfqgvgsgatlvvttlgesptavsa。

10、seq?id?no.3mic3基因的核苷酸序列(5’-3’)：

11、atgcgaggcgggacgtccgcgctgttgcacgcgctcaccttcagtggggccgtgtggatgtgcaccccagcggaggctttgccgattcagaagtctgtgcagctgggcagctttgacaaagttgtgccgagccgcgaagtcgtctctgagagtcttgctccgtctttcgcggtgactgagactcactcgtctgtgcaatcccccagcaagcaggagacgcaactctgtgctatctcgagtgaaggcaagccatgtcgaaaccgtcagttgcacactgacaacgggtacttcatcggggccagttgccccaagagcgcttgctgcagcaagaccatgtgcggccccggcggctgcggagaattctgctccagcaactggattttttgcagcagttcgctcatctaccatcctgacaaaagctatggaggagactgcagctgtgaaaagcagggccatcggtgcgacaaaaacgcagaatgcgtcgaaaacttggacgcgggtgggggtgtgcactgcaagtgcaaagacggcttcgtcggcactgggttgacttgctccgaggatccttgttcaaaaagagggaacgcgaagtgcggacccaacgggacgtgcatcgtcgtcgattcagtcagctacacatgcacctgcggcgacggcgaaactctagtgaacctcccggaagggggacaaggatgcaagaggactggatgtcatgccttcagggagaactgcagccctggtagatgtattgatgacgcctcgcatgagaatggctacacctgcgagtgccccacagggtactcacgtgaggtgacttccaaggcggaggagtcgtgtgtggaaggagtcgaagtcacgctggctgagaaatgcgagaaggaattcggcatcagcgcgtcatcctgcaaatgcgataacggatactccggatctgcttccgcaacctcccaccatgggaaaggagaatcgggatccgaggggagcttgagtgaaaaaatgaatattgtcttcaagtgccccagtggctaccatccaagataccatgcccacaccgtgacgtgtgagaaaattaagcactttgcccttgacggggccggcaaccacgacacgactacgtatgtcgcaagacgaaggtacccagcgagtctctga。

12、seq?id?no.4mic3基因的氨基酸序列(5’-3’)：

13、mrggtsallhaltfsgavwmctpaealpiqksvqlgsfdkvvpsrevvseslapsfavtethssvqspskqetqlcaissegkpcrnrqlhtdngyfigascpksaccsktmcgpggcgefcssnwifcsssliyhpdksyggdcscekqghrcdknaecvenldagggvhckckdgfvgtgltcsedpcskrgnakcgpngtcivvdsvsytctcgdgetlvnlpeggqgckrtgchafrencspgrciddashengytcecptgysrevtskaeescvegvevtlaekcekefgisassckcdngysgsasatshhgkgesgsegslsekmnivfkcpsgyhpryhahtvtcekikhfaldgagnhdtttyvarrrypasl。

14、弓形蟲弱毒株：

15、rhδku80δhxgprt；tub1:tir1-3flag,sag1:cat；δmic3::dhfr-ts:dhfr；δmic1::dhfr-ts:hxgprt(δmic1δmic3)，為系統(tǒng)評估其免疫調(diào)控效能，采用cck-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移模型及熒光探針(如dcfh-da標(biāo)記ros)等多維度分析技術(shù)，定量解析該弱毒株對巨噬細(xì)胞增殖、遷移、趨化、活性氧、吞噬功能及凋亡的調(diào)控作用。進(jìn)一步通過qpcr測定蟲體感染巨噬細(xì)胞后炎性細(xì)胞因子ifn-γ，il-6、il-1及inos的mrna表達(dá)水平，為闡明弓形蟲-宿主互作的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及開發(fā)基于弱毒株的疫苗設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

16、第二方面，本發(fā)明提供一種上述弓形蟲弱毒株的構(gòu)建方法，通過crispr-cas9技術(shù)敲除所述mic1基因和mic3基因，獲得所述弓形蟲弱毒株。

17、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步地，包括以下步驟：

18、步驟s1、構(gòu)建所述mic1基因和mic3基因的crispr-cas9敲除質(zhì)粒；

19、步驟s2、擴(kuò)增所述mic1基因的hxgprt同源片段，擴(kuò)增所述mic3基因的dhfr同源片段；

20、步驟s3、將步驟s1的所述敲除質(zhì)粒、步驟s2的所述hxgprt同源片段和dhfr同源片段，共同電轉(zhuǎn)至親本弓形蟲蟲株中，經(jīng)藥物篩選、pcr鑒定，獲得所述弓形蟲弱毒株。

21、其中，步驟s2以pl-aid-6ty-hxgprt質(zhì)粒為模板，通過pcr擴(kuò)增獲得用于同源替換mic1基因的hxgprt片段；

22、以pl-aid-6ty-dhfr質(zhì)粒為模板，通過pcr擴(kuò)增獲得用于同源替換mic3基因的dhfr片段。

23、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步地，所述親本弓形蟲蟲株為弓形蟲i型蟲株。

24、本技術(shù)的弓形蟲i型蟲株為tir1蟲株。

25、第三方面，本發(fā)明提供一種上述弓形蟲弱毒株在制備弓形蟲疫苗中的應(yīng)用。

26、第四方面，本發(fā)明提供一種弓形蟲疫苗。

27、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

28、(1)本發(fā)明利用crispr-cas9技術(shù)，以tir1弓形蟲為親本蟲株，敲除了弓形蟲mic1和mic3基因，構(gòu)建得到δmic1δmic3蟲株。該蟲株在降低蟲體入侵能力的同時(shí)能有效增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，包括吞噬能力和分泌tnf-α、il-12等促炎因子。

29、(2)本發(fā)明的弓形蟲弱毒株為闡明弓形蟲-宿主互作的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定重要基礎(chǔ)。